杏香气形成特异基因PaCCD1的克隆与功能分析

以‘轮台小白杏’果实为材料，利用转录组测序筛选获得的类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD1基因片段设计特异引物，使用 RACE技术克隆全长cDNA序列，命名为PaCCD1。该基因长为1 885 bp，开放阅读框（ORF）1 644 bp，编码547个氨基酸残基，蛋白质分子量为61.699 kD。氨基酸序列比对发现，PaCCD1与甜瓜等其他已知功能的CCD1相似，具有4个保守的组氨酸残基、2个半保守的谷氨酸残基和1个天冬氨酸残基。活性位点分析表明，PaCCD1编码的蛋白存在多个糖基化位点和磷酸化位点。进化树分析表明，PaCCD1与AtCCD1（拟南芥）及碧桃等的CCD1在同一分支上，其中与PpCCD1（碧桃）和CmCCD1（甜瓜）的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明，PaCCD1在杏幼果中表达量最高，在花中表达量次之，而在根、叶和1年生枝条中不表达，具有组织表达特异性。杏果实发育和成熟过程中，果皮和果肉中PaCCD1的表达均显著上调，主要类胡萝卜素β–胡萝卜素和叶黄素的含量显著下降，而脱辅基类胡萝卜素类香气物质二氢–β–紫罗兰酮、β–紫罗兰酮和β–大马酮的含量显著增加。将目的基因通过转化大肠杆菌，获得了体外表达蛋白，饲喂类胡萝卜素的底物特异性测定发现，PaCCD1蛋白能较快吸收β–胡萝卜素产生二氢–β–紫罗兰酮和β–紫罗兰酮，能吸收叶黄质产生β–大马酮。据此推测PaCCD1是控制杏果实脱辅基类胡萝卜素类香气物质形成的关键基因。