月季新型PKSⅢ基因的生物信息学分析及原核表达

【目的】对月季Ⅲ型聚酮合酶基因（RcPKSⅢ）进行生物信息学和原核表达分析，为进一步探究该基因的催化功能奠定基础。【方法】以‘月月粉’花瓣为研究材料，从其基因组中筛选月季PKS基因（RcPKSs）家族成员，并对其进行生物信息学分析；利用MEGA软件对RcPKSs与其他植物PKS氨基酸序列进行系统发育分析；利用DNAMAN软件对RcPKSs和紫花苜蓿查尔酮合酶2（CHS2）基因进行序列比对分析；对RcPKSs和紫花苜蓿CHS2活性位点上的氨基酸残基进行比较，分析其催化特征；利用SWISS-MODEL对RcPKSs进行同源建模，并与紫花苜蓿CHS2蛋白三维结构进行比较。利用实时荧光定量PCR方法，分析RcPKSs和间苯三酚甲基化酶编码基因在‘月月粉’花蕾期、半开期和盛开期的表达模式；克隆RcPKSs基因全长，构建其原核表达载体pET-32a-RcPKSs，进行诱导表达，并对重组蛋白进行纯化。【结果】从‘月月粉’基因组中共鉴定出6个RcPKSs，生物信息学分析表明，RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3为CHS基因，RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6为新型PKSⅢ基因。系统发育分析表明，RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3编码CHS蛋白，RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6编码新型的非CHS蛋白。序列比对分析表明，RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3蛋白与紫花苜蓿CHS2相似度均为72.16%，RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6与紫花苜蓿CHS2相似度分别为67.52%，33.85%和32.73%。活性位点上氨基酸残基比较发现，RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3活性位点上氨基酸残基均保守，RcPKS4氨基酸残基在起始口袋和延伸口袋处发生替换，RcPKS5和RcPKS6氨基酸残基均在延伸口袋处发生替换。对RcPKSs蛋白质结构的分析结果显示，RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6蛋白质采用了几乎相同的αβαβα三维整体折叠形式。实时荧光定量分析表明，RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6表达量在‘月月粉’花朵盛开期最高，间苯三酚O-甲基转移酶基因（POMT）、苔黑酚O-甲基转移酶基因1（OOMT1）和OOMT2表达量在盛开期最低。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果表明，重组蛋白诱导并且纯化成功。【结论】鉴定了‘月月粉’新型RcPKSⅢ基因，该基因可能参与花发育调控过程。克隆了RcPKSs基因，并诱导表达获得了RcPKSs重组蛋白。