| 伪狂犬病病毒在NF-κB家族p65基因敲除细胞系的复制规律研究 |
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| 作者姓名： | 常雯茹 段利芳 杨乐 马英先 王棋 翟云云 周鲁豫 张爽 明胜利 杨国宇 王江 褚贝贝 |
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| 作者单位： | 1. 河南农业大学, 农业农村部动物生化与营养重点开放实验室, 郑州 450002;2. 河南农业大学, 国家动物免疫学国际联合研究中心, 郑州 450002 |
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| 基金项目： | 优势特色学科建设经费（203/18xk0102）；万人计划青年拔尖人才（W03070106）；河南省高校青年骨干教师（2016GGJS-033）；河南省自然科学基金面上项目（83）；河南省重点研发与推广专项（202102110100） |
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| 摘 要： | 试验旨在研究伪狂犬病病毒（PRV）在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒，转染至HEK293T/17细胞，收取慢病毒，感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系，T7核酸酶检测敲除效率，再通过有限稀释法获得3D4/21-p65-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响；流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65-/-细胞后病毒增殖的差异；实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化；Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达；滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明，sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高，对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系；CCK-8试剂盒检测细胞活力表明，p65基因敲除对细胞活力无影响；流式细胞仪检测表明，同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65-/-中的增殖显著高于对照细胞；实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平，而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达；Western blotting结果表明，在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达；滴度测定结果表明，同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明，p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。
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| 关 键 词： | CRISPR/Cas9 NF-κB 猪 伪狂犬病病毒(PRV) |
| 收稿时间： | 2020-06-19 |
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