甘蔗黄叶病毒P0基因的克隆与原核表达及抗血清制备

根据已发表ScYLV-P0基因系列设计特异性引物,应用RT-PCR技术从甘蔗病叶的mRNA扩增得到目的 DNA片段。以pET32a(+)为原核表达载体,构建重组表达质粒pET32a-P0。经过双酶切鉴定和DNA测序后,将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)pLySs,在30℃培养条件下IPTG诱导表达。通过SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达情况。表达结果显示,在该表达系统中,融合表达蛋白P0是以包涵体形式的蛋白存在;P0融合蛋白大小约45kDa,与P0开放阅读框的理论推算值29.991 kDa加上载体自身蛋白约18 kDa相符,用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白,免疫家兔制备出抗血清,通过酶联法(ID-ELISA)测定本实验制备的ScYLY-P0抗血清工作浓度为1∶25000。