烟草NtTkr尾部T1084缺失和替换突变原核表达载体的构建及诱导表达

已知烟草驱动家族新成员NtTkr尾部第3个卷曲螺旋(Coiled-coil, CC3)第1 084位苏氨酸(T_(1084))对靶蛋白的结合至关重要,通过对NtTkr尾部的酵母双杂交筛选得到多个与Ntkr互作的候选蛋白。为确定T_(1084)缺失(T_(1084d))或替换(T1084A)突变对NtTkr与这些候选蛋白体外互作的重要性,首先以pBI121-NtTkr为模板,通过重叠延伸PCR扩增得到烟草NtTkr尾部T_(1084d)、T1084A片段并将其克隆入质粒pUC19,经蓝白斑筛选、SmaⅠ-BamHⅠ双酶切鉴定后送去测序,获得正确的T_(1084)缺失和替换的NtTkr尾部;然后将重组的pUC19-T_(1084d)、pUC19-T1084A与pMXB10进行NotⅠ-NdeⅠ双酶切,回收目的片段和载体片段并连接,连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α,筛选得到重组子,进行NotⅠ-NdeⅠ双酶切鉴定,最终成功构建pMXB10-NtTkr-T1084A和pMXB10-NtTkr-T_(1084d)原核表达载体;最后将原核表达载体pMXB10-T_(1084d)和pMXB10-T1084A转入BL21(DE3)中,分别经0.05,0.06 mmol/L IPTG浓度诱导,12%SDS-PAGE电泳检测蛋白质表达情况,结果证明获得了NtTkr-T_(1084d)-1317和NtTkr-T1084A-1320的成功表达,且IPTG浓度大于0.06 mmol/L时,均可高效表达约77 ku的NtTkr-T1084A-1320和76.2 ku的NtTkr-T_(1084d)-1317蛋白量。