栽培稻(Oryza sativa L.)亚种间F1花粉不育基因S-a的精细定位及克隆

水稻籼粳亚种间存在着强大的杂种优势,但杂种育性普遍偏低成为这一杂种优势利用的主要障碍.研究证明,花粉不育是导致杂种不育的主要原因之一.张桂权和卢永根等(1987-1994)鉴定了6个花粉不育基因座位(S-a,S-b,S-c,S-d,S-e和S-f).其中S-a基因座位已被庄楚雄等(1996)初步定位在水稻第一染色体着丝粒附近.本论文是在此基础上,利用美国Cornell大学、日本RGP构建的水稻高密度遗传图和日本构建的BAC/PAC物理图及其基因组测序资料,对S-a作进一步的精细定位,建立了包含该基因的TAC重叠群,并通过序列分析发现S-a候选基因,为分离鉴定S-a基因及研究该基因在水稻杂种不育中的分子作用机理打下了基础.本研究主要结果如下1. 构建了台中65(含S-aj) 及其近等基因系TILS4(E4,含S-ai )杂交的F2群体,观察了706株F2个体的花粉育性分离状况.其中可育株367株,半不育株339株,分离比为1∶1.2. 利用前人筛选的多态性标记R2159、R1928和本研究新获得的多态性标记GR2、GR1、AR1、D2.3M、D1.5S、F12M1,用706株F2群体对S-a进行了的精细定位.结果表明S-a与分子标记R2159、GR2、GR1、AR1、R1928、F12M1、D1.5S和D2.3M之间的遗传距离分别为2.07cM,1.21cM,0.65cM,0.42cM,0.42cM,0.45cM,0.14cM和0cM.与S-a紧密连锁的5个分子标记(<0.5cM)分布在S-a两侧,其中D2.3M为S-a的0cM标记.依据该区域物理距离对遗传距离的平均换算值200kb/cM,将基因定位在约30kb范围内.3. 构建了籼稻广陆矮4(含S-aj)、粳稻台中65(含S-aj)和S-ai近等基因系(E4)的基因组TAC文库,各文库分别包含12万、10万和11万平均大小为43kb的克隆,各文库覆盖率平均约达10倍水稻基因组大小.依据定位结果,用覆盖S-a的100kb范围内所设计的单/低拷贝片段为探针,筛选粳稻台中65、籼稻广陆矮4和不育近等基因系E4的TAC基因组文库,构建了基于TAC克隆的S-a座位的物理图.4. 根据基因序列分析,在与S-a座位完全连锁的标记D2.3M两旁30kb范围内发现了3个开放读码框,其中一个是具有bHLH结构域的转录因子,一个是N端有DENN结构C端有8WD40重复的转录因子,另一个是丝氨酸/苏氨酸型的蛋白激酶.本研究将其定为S-a的候选基因,分别进行基因序列及其表达的分析.5. 用特异引物进行RT-PCR,从台中65和E4小穗RNA中扩增出HLH转录因子的cDNA片段.测序分析表明该片段与预测的外显子结构一致.利用RT-PCR和Southern杂交证明该bHLH在E4和T65的幼穗部表达,但表达量很低.同时进行的RT-PCR也证明WD40重复的转录因子在E4的幼穗中表达.8WD40重复的转录因子和蛋白激酶基因的进一步测序和基因表达分析工作正在进行中.

Fine Mapping and Cloning of the Gene S-a for F1 Pollen Sterility in Cultivated Rice (Oryza sativa L.)