黄瓜花叶病毒辣椒分离物侵染性克隆构建

 【目的】鉴定引起辣椒产生褪绿黄化症状的病原物，构建侵染性克隆。【方法】大田辣椒样品通过ELISA检测，结合病毒外壳蛋白SDS-PAGE及病毒RNA分析，初步确定辣椒中病原物为黄瓜花叶病毒（CMV）Phy株系。以辣椒病毒粒子RNA为模板，采用含T7启动子的不同正向引物通过RT-PCR扩增CMV-Phy全长基因组RNA1、RNA2和RNA3。PCR产物经过双酶切后连接到pUC118载体，并分别比较5种（DH5α、HB101、JM109、LE392和NM522）感受态细胞的转化效率。体外转录CMV-Phy的基因组cDNA克隆（pUC-P1、pUC-P2和pUC-P3）成RNA分子（P1P2P3），分析其转录效率和侵染活性。P1P2P3与CMV的卫星RNA进行假重组，进一步确定CMV-Phy侵染性克隆的成功构建。【结果】引起辣椒产生褪绿黄化症状病原物为CMV，携带卫星RNA；心叶烟接种辣椒病毒粒子后同样产生褪绿黄化症状。HB101感受态细胞最适合CMV-Phy基因组转化。CMV-Phy基因组及其卫星RNA的大小如下：RNA1为3 356 nt、RNA2为3 048 nt和RNA3为2 220 nt，卫星RNA Pz-satRNA为384 nt（序列登陆号分别为：DQ402477，DQ412731 ，DQ412732 EF363688）。CMV-Phy的cDNA克隆体外转录在5′端添加G有利于提高转录效率，但影响其侵染活性；P1P2P3在苋色藜和心叶烟产生的症状与其病毒粒子产生的症状相一致。除了Pz-satRNA，P1P2P3还能作为T1-satRNA、Rs-satRNA和Tsh-satRNA辅助病毒；T1-satRNA可加重CMV-Phy在心叶烟症状反应，而其它3个卫星RNA则对此起减弱作用。【结论】以病毒粒子RNA为模板，采用touch-up PCR扩增参数在1个反应管中同时获得CMV-Phy基因组RNA1、RNA2和RNA3；CMV-Phy RNA1、RNA2和RNA3的5′端添加1个G最有利于侵染性克隆构建。

Construction of Infectious Clone for Cucumber Mosaic Virus Pepper Isolate