草原短尾羊Brachyury蛋白多克隆抗体制备

【目的】克隆草原短尾羊Brachyury基因（即T基因）编码区（CDS），并制备Brachyury蛋白特异性多克隆抗体，为草原短尾羊短尾表型机制研究提供重要的试验材料。【方法】提取草原短尾羊16 d胚胎的组织RNA，反转成cDNA，以cDNA为模板，采用PCR方法克隆草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列。将Brachyury基因CDS全长序列连接至pEASY-Blunt E1载体，构建原核表达载体pEASY-Blunt E1-Brachyury，并进行Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定。将原核表达载体导入RosettagamiB（DE3）大肠杆菌，并进行IPTG诱导表达，对表达产物进行回收纯化。利用纯化后的表达产物免疫6周龄日本大耳白兔，用间接ELISA（iELISA）法测定血清多克隆抗体效价。以制备的多克隆抗体为一抗，采用Western blot法检测草原短尾羊16，20，25和30 d胚胎中Brachyury蛋白的表达水平。【结果】克隆了1 335 bp的草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列，成功构建了原核表达载体pEASY-Blunt E1-Brachyury，表达获得了49.16 ku的重组Brachyury蛋白。成功制备了重组Brachyury蛋白多克隆抗体，抗体效价达1∶1 500，该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。草原短尾羊16 d胚胎中Brachyury蛋白的表达量最高。【结论】成功制备草原短尾羊Brachyury蛋白兔血清多克隆抗体，抗体效价为1∶1 500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。

Preparation of polyclonal antibody against Brachyury protein of prairie short-tail sheep