猪TNF-α高效表达及其多克隆抗体的制备

【目的】明确猪源肿瘤坏死因子α（TNF-α）多克隆抗体的特异性和反应性，并探索猪瘟病毒（CSFV）感染对PK-15细胞分泌TNF-α的影响，为揭示CSFV的致病机理打下基础。【方法】提取CSFV病料基因组RNA，通过RT-PCR扩增TNF-α基因，构建原核表达载体pGEX-4T-1-TNF-α并转化BL21感受态细胞诱导表达融合蛋白，经纯化和浓缩后免疫SPF级昆明小鼠制备TNF-α多克隆抗体；同时构建真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α，分别转染HEK-293T细胞和PK-15细胞表达融合蛋白，通过Western blotting、ELISA和间接免疫荧光分析等方法检测TNF-α多克隆抗体效价、反应性及特异性。【结果】以原核表达载体pGEX-4T-1-TNF-α转化BL21感受态细胞，经IPTG诱导后能表达出约43 kD的融合蛋白，且主要以包涵体形式进行表达。以真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α转染HEK-293T细胞可表达出25 kD的融合蛋白，主要在细胞质中表达，且均匀分布。制备获得的TNF-α多克隆抗体能与转染HEK-293T细胞表达的融合蛋白TNF-α及PK-15细胞的内源蛋白TNF-α发生良好反应，即具有较好的反应特异性，其抗体效价高达1∶8000。CSFV能刺激PK-15细胞分泌蛋白TNF-α上调表达，且TNF-α与其下游因子（TRAF1）的表达变化趋势基本一致，即二者间存在一定关联性。【结论】制备获得的TNF-α蛋白抗体具有效价高、反应性好及特异性强的特点，可用于检测CSFV感染后真核细胞中过表达的TNF-α水平。TNF-α可刺激TRAF1产生，参与TRAF1相关信号通路而发挥其生物学功能，CSFV感染PK-15细胞后TNF-α和TRAF1的表达变化趋势基本一致，说明CSFV能刺激TNF-α和TRAF1信号通路，使机体产生炎症反应。