鸡白痢沙门氏菌IPAJ蛋白的表达纯化、多克隆抗体制备及ELISA方法的建立

【目的】试验旨在建立以鸡白痢沙门氏菌的毒力相关基因所编码的IPAJ蛋白为抗原的间接ELISA方法。【方法】PCR扩增IPAJ基因并连接到pCzn1表达载体上，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，IPAJ基因重组蛋白用IPTG进行诱导表达并纯化，通过Western blotting验证蛋白的反应原性。用纯化的IPAJ蛋白免疫60日龄试验兔，共免疫3次，制备其多克隆抗体，通过ELISA方法检测抗体效价。采用方阵滴定法优化以IPAJ蛋白作为诊断抗原的ELISA条件，初步建立以IPAJ蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法，并与平板凝集试验结果进行比较。【结果】试验成功构建鸡白痢沙门氏菌IPAJ原核表达载体，并以包涵体形式纯化出重组蛋白，具有良好的反应原性。Western blotting分析结果显示，成功表达出32 ku的IPAJ蛋白，具有良好的特异性。间接ELISA检测结果显示，多克隆抗体效价为1∶25 600,表明成功制备出多克隆抗体。建立的以IPAJ蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法的最佳优化条件为：抗原包被浓度为5μg/mL,5%脱脂奶粉封闭1.5 h,一抗最佳稀释浓度为1∶250...