BMP4在牦牛和犏牛睾丸组织及支持细胞中的差异表达分析

【目的】从牦牛和犏牛睾丸组织中分离培养支持细胞，检测骨形态发生蛋白4基因（BMP4）及其受体基因在牦牛、犏牛睾丸组织及支持细胞中的表达情况，为深入研究BMP4对犏牛精子发生过程的作用提供理论基础。【方法】采集12月龄牦牛和犏牛睾丸组织，使用Trizol法提取各睾丸组织总RNA，利用RT-PCR技术检测BMP4及其受体基因（骨形态发生蛋白受体1B型(ALK6)、骨形态发生蛋白受体2型(BMPR2)、激活素A受体2A型(ACVR2A)、激活素A受体2B型(ACVR2B)）的mRNA表达水平。通过两步酶法消化睾丸组织制备细胞悬液，经差速贴壁、饥饿处理和胰酶消化分离纯化牦牛和犏牛睾丸支持细胞。采用HE染色、油红O染色、碱性磷酸酶（ALP）染色、免疫荧光染色鉴定支持细胞，用Trizol法提取细胞总RNA，RT-PCR检测支持细胞、生精细胞、间质细胞、类肌细胞标志基因和BMP4及其受体基因的mRNA表达水平。采用实时荧光定量PCR检测BMP4及其受体基因在牦牛和犏牛睾丸支持细胞中的差异表达情况。【结果】HE染色结果显示，第3代（F₃）支持细胞呈长条形或梭形。油红O染色结果显示，体外培养的细胞胞质中有明显脂滴积累，且在细胞核内可观察到支持细胞特有的双极小体结构。ALP染色结果显示，细胞不着色。免疫荧光染色结果显示，支持细胞标志蛋白GATA 结合蛋白4(GATA4）呈阳性表达。RT-PCR检测结果显示，支持细胞标志基因BMP4、SRY-box转录因子9基因（SOX9）、波形蛋白基因(Vimentin)、Wilm肿瘤抑制基因(WT1)、FAS细胞表面死亡受体基因(FAS）和胶质细胞源性神经营养因子基因(GDNF)存在明显表达，而生精细胞标志基因出局区解旋酶4(DDX4)和类肌细胞标志基因半胱氨酸的血管生成诱导剂61(CYR61)无明显表达，间质细胞标志基因细胞色素P450家族11亚家族A成员1(CYP11A1)则有少量表达。BMP4在牦牛和犏牛睾丸支持细胞中都有表达，且在牦牛支持细胞中的表达量显著高于犏牛支持细胞，而其受体基因ALK6、BMPR2、ACVR2A和ACVR2B在牦牛支持细胞中的表达量显著或极显著低于犏牛支持细胞。【结论】从牦牛和犏牛睾丸组织中分离获得支持细胞，BMP4在牦牛支持细胞中表达量较高，暗示BMP4对犏牛精子发生具有潜在调控作用。

Differential expression of BMP4 in testicular tissue and sertoli cells of yak and cattleyak