CRISPR/Cas9系统敲除山羊TLR4基因载体构建及检测

TLR4是天然免疫系统中的一种重要模式识别受体,可选择性地识别病原微生物而启动天然免疫,在宿主天然免疫和获得性免疫中具有重要作用。山羊TLR4基因与多种疾病相关,然而,目前在山羊上关于TLR4基因敲除及相关功能的研究尚未见报道。采用CRISPR/cas9系统,首先设计TLR4基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列,构建同时表达sgRNA和Cas9 D10A的质粒PYSY-sgRNA,连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,最后对转化子进行验证,提取质粒并转染山羊成纤维细胞,通过测序进行敲除检测。结果表明:酶切和测序鉴定证明TLR4基因敲除载体构建正确。说明采用CRISPR/Cas9构建的载体,可为后续研究TLR4在支原体肺炎感染的免疫应答分子机制提供理论依据。