家蚕Bm30Kc6蛋白对过氧化氢诱导的家蚕细胞凋亡的抑制作用

30K蛋白是一类家蚕(Bombyx mori)血淋巴中具有最强抗细胞凋亡活性的蛋白,家蚕Bm30Kc6蛋白作为30K蛋白家族的成员之一,也具有较强的抗细胞凋亡作用,但其抗细胞凋亡的作用机制还不十分清楚。本研究将本实验室成功构建的重组病毒Bacmid-Bm30Kc6接种家蚕BmN细胞大量表达后,利用Ni-NTA蛋白亲和层析柱纯化重组蛋白Bm30Kc6。SDS-PAGE和Westernblot检测结果显示纯化蛋白的纯度较高。然后利用不同浓度(0.1、1、5和10mmol/L)的H2O2处理家蚕BmN细胞,诱导细胞发生凋亡,结果表明,在培养基中加入终浓度为5mmol/LH2O2孵育4h后即可成功诱导BmN细胞凋亡。在上述建立的H2O2诱导的家蚕BmN细胞凋亡体外损伤模型的基础上,分析了Bm30Kc6蛋白的抗细胞凋亡的活性及作用机制。首先利用CelldeathDetection ELISA试剂盒检测了细胞内的DNA片段化程度,检测结果表明,Bm30Kc6蛋白(终浓度5μg/mL)可明显降低H2O2诱导的家蚕BmN细胞内的DNA片段化程度。然后利用Cellproliferation ELISA试剂盒检测了细胞的增殖情况,结果表明,Bm30Kc6蛋白可以显著增强家蚕BmN细胞的活力。进一步利用8-isoprostane EIA试剂盒检测细胞内氧化应激标志物8-isoprostane的浓度变化,结果显示,家蚕Bm30Kc6蛋白可以显著降低胞内8-isoprostane的浓度。此外,Western blot分析结果显示,Bm30Kc6蛋白可显著抑制家蚕BmN细胞中细胞色素c从线粒体中释放进入细胞质。Bm30Kc6蛋白一方面可以通过降低BmN细胞内的氧化应激水平从而起到抑制细胞凋亡的作用;另一方面,Bm30Kc6蛋白也可以通过阻断H2O2诱导激活的线粒体通路来抑制细胞发生凋亡。本研究将为进一步深入研究家蚕Bm30Kc6蛋白的抗凋亡机制提供基础资料。