普通小麦几丁质酶基因的克隆与表达分析

几丁质酶是植物重要的防卫因子之一,与植物抗病性密切相关。为深入了解几丁质酶基因表达及功能,先利用引物ChiF/ChiR从10份具有不同抗病性的小麦中克隆出几丁质酶基因后对其进行序列分析及原核表达分析,再利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析小麦根、茎和叶不同组织中几丁质酶基因的表达情况,并选取在小麦根、茎和叶中表达量最高的几丁质酶基因进行真菌性病害的抗性反应试验。结果表明,从10份具有不同抗病性的小麦中克隆得到5条长度约960bp的几丁质酶基因序列,其中1条序列与已公布的Chi-3基因序列(序列登录号为KJ507387)一致,其余序列命名为Cht1~Cht4(GenBank登录号为KR049247~KR049250)。序列分析表明,克隆所得序列无内含子,编码的几丁质酶属于ClassⅠb类型,也属于糖苷水解酶第19家族,是胞外分泌蛋白且兼具溶菌酶活性。SDS-PAGE分析表明,重组质粒pE-Chi能在BL21(DE3)中表达一个33kDa左右的特异蛋白。qRT-PCR分析表明,这5种几丁质酶基因在小麦根、茎和叶中均有表达,但在不同器官中表达量差异较大,其中,叶中表达量最高,根中次之,茎中最低;同时,这5种几丁质酶基因在同一器官中表达量大小具体表现为Cht4Cht2Cht3Cht1Chi-3。选取相对表达量最高的Cht4基因验证其对真菌性病害的抗性反应,结果表明,在条锈菌胁迫下,Cht4基因在抗病材料92R137中的表达量显著高于感病材料铭贤169,并且均高于同等条件下接ddH2O的表达量。本研究扩增到的几丁质酶基因在小麦中组成型表达,说明其参与了小麦的正常生长发育过程;Cht4基因的表达受条锈菌诱导,推测其可能参与了小麦叶部抗条锈菌的防御反应。

Cloning and Expression Analysis of Chitinase Genes in Common Wheat (Triticum aestivum L.)