绵羊sTLR4基因的克隆表达及定位

采用RT-PCR方法克隆绵羊TLR4基因的一种新型剪接体形式sTLR4,将sTLR4与EGFP构建融合蛋白表达载体。用EcoR I和Sma I分别双酶切质粒pEGFP-N1和sTLR4基因的PCR产物,采用T4连接酶进行连接,将质粒转化TOP10菌株,挑取阳性克隆采用AgeI和VspI对质粒进行双酶切鉴定。经鉴定的质粒采用电击方法转染胎儿成纤维细胞,在激光共聚焦显微镜下观察sTLR4蛋白在成纤维细胞中的定位情况。结果表明:构建的融合蛋白pEGFP-N1-sTLR4能够在成纤维细胞中正常工作,且sTLR4-EGFP融合蛋白可以在细胞膜上表达。