松材线虫乙酰胆碱酯酶1基因沉默及蛋白抑制剂

目的]为提高苦参碱的杀虫效果,对松材线虫的药剂防治靶标乙酰胆碱酯酶1基因(BxACE1)进行研究.方法]松材线虫采集自广东省内马尾松,贝曼漏斗法分离,灰葡萄孢菌苔上25℃避光培养扩繁线虫.克隆BxACE1基因全长并进行序列分析,通过基因沉默和蛋白抑制2种技术阻断该基因功能,研究苦参碱的杀虫效果,并应用Q-PCR技术鉴定RNAi效果.结果]5′和3′序列拼接得到基因全长2 145 bp,命名为BxACE1.同源序列多序列比对表明线虫ACE的进化速度与线虫进化速度一致.蛋白质三维结构分析表明,BxACE1由14个α螺旋包围着13个β折叠,鉴于氢键数量越多结合越稳定,利用docking技术筛选出石杉碱甲是松材线虫乙酰胆碱酯酶1蛋白的较佳抑制剂.RNAi明显增加了苦参碱的杀虫效果,石杉碱甲本身对线虫毒性较小,共同施用RNAi和石杉碱甲对线虫毒性仍然较小,但RNAi处理组线虫与Inhibitor(0.03％苦参碱+1μmol· L-1石杉碱甲处理线虫)处理组线虫在24,48及72h存活率差异不显著,表明石杉碱甲处理线虫和BxA CE1基因RNAi处理效果相近.结论与其他]通过基因沉默和蛋白抑制2种技术阻断BxACE1功能均可以提高苦参碱的杀虫效果,RNAi技术能够简单易行地证明若阻断BxACE1功能可以提苦参碱的杀虫效果,但dsRNA容易降解等因素限制了该技术在生产实践中的广泛应用.石杉碱甲可以与BxACE1稳定结合,鉴定表明石杉碱甲可以提高苦参碱的杀虫效果,具有生防药剂辅剂的开发潜力,可替代基因沉默技术实现抑制BxACE1的目的.因此,通过乙酰胆碱酯酶抑制剂石杉碱甲可阻断BxACE1的功能,进而达到提高苦参碱等植物源药剂杀虫效果的目的.ACEIs通过抑制线虫体内的乙酰胆碱酯酶的活性,使线虫体内的胆碱水平短时间内大量提高,从而导致其中毒死亡.该类具有代表性的杀虫剂是有机磷类化合物和氨基甲酸酯类化合物,大多为非可逆型ACEIs.石杉碱甲是来源于石杉科植物蛇足石杉的一种半萜生物碱,是一种高效、高选择性、可逆性的ACEIs.本研究将石杉碱甲引入松材线虫研究,是对该植物源药剂的一个新尝试.

BxACE1 Gene RNAi and Protein Inhibition of Acetylcholinesterase in Pine Wood Nematode Bursaphelenchus xylophilus