苹果潜隐性病毒一步三重检测体系的建立与优化

【目的】在两步单重检测体系基础上,建立能同时检测苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果茎沟病毒(ASGV)和苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)的一步三重检测体系,以简化苹果潜隐性病毒检测方法。【方法】以携带ASPV、ASGV、ACLSV的苹果优系‘浓果-25’组培苗为试材,比较一步单重、一步两重和一步三重RT-PCR 3种检测体系的检测效果,对一步三重检测法中的退火温度、反转录时间、延伸时间、循环数和引物加量进行优化,并用带毒情况不同的苹果田间根茎叶、组培苗、脱毒苗对优化后的RT-PCR一步三重检测体系进行验证。【结果】一步单重RT-PCR体系一次只能检测1种病毒,一步两重RT-PCR体系一次能同时检测2种病毒,一步三重RT-PCR体系一次能同时检测3种病毒。优化后的一步三重RT-PCR检测体系为:50℃反转录20 min;94℃预变性20 min;94℃变性30 s,53～56℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环,引物加量为各病毒上、下游引物(10μmol/L)各1.0μL,无需进行终延伸。优化后的一步三重检测体系验证结果与两步单重检测结果一致,初步证明该检测体系合理。【结论】建立了苹果潜隐性病毒一步三重检测体系,该体系能同时对苹果样品中ASPV、ASGV和ACLSV 3种病毒进行检测。