维氏气单胞菌AcrV基因的克隆与原核表达

【目的】克隆维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）低钙反应蛋白（AcrV）并进行原核表达，为进一步研究AcrV蛋白的结构功能及AcrV基因工程亚单位疫苗的制备奠定基础。【方法】克隆维氏气单胞菌TH0426菌株AcrV基因，通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级结构及三级结构。将AcrV基因克隆到pET-30a(+)原核表达载体上，构建原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV，将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，进行EcoR Ⅴ和Xho Ⅰ双酶切鉴定和测序鉴定。用IPTG对 pET-30a(+)-AcrV进行诱导表达，对IPTG浓度（0.2，0.4，0.6和0.8 mmol/L）和诱导时间（2，3，4和5 h）进行优化。在最佳条件下诱导表达重组蛋白AcrV，经镍柱纯化且尿素梯度复性后免疫BALB/c小鼠，制备多克隆抗体，进行SDS-PAGE及Western blot分析，对目的蛋白的免疫原性进行检测。【结果】成功获得了1 086 bp的AcrV全基因，编码361个氨基酸。AcrV蛋白是无跨膜结构且不编码信号肽的蛋白，有2个高度保守的结构功能域，属于全α型蛋白。成功构建了原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV，其最佳诱导表达条件为IPTG 0.8 mmol/L诱导5 h。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示，AcrV蛋白能被鼠抗阳性血清识别，表明其具有一定的反应原性。【结论】成功克隆了1 086 bp的AcrV基因，分析了其编码蛋白的生物信息；获得了免疫原性良好的重组AcrV蛋白。