米胚芽谷氨酸脱羧酶的分离纯化及部分酶学性质的研究

【目的】分离纯化米胚芽谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD),并对其酶学性质进行研究。【方法】通过(NH4)2SO4分级沉淀、DEAE-Sephrose FF离子交换色谱、Superdex 200凝胶过滤色谱和Glu SephroseCL 4B亲和色谱等分离纯化技术,对米胚芽GAD进行分离纯化。用体积排阻高效液相色谱测定米胚GAD的相对分子质量,SDS-PAGE测定其亚基的相对分子质量。测定米胚GAD的最适温度和pH,通过酶动力学试验测定其动力学常数(Km)和最大反应速度(Vmax),并测定KCl和MgSO4等化学物质对酶活性的影响。【结果】分离纯化得到了米胚GAD,其纯化倍数为65.7,比活达223.4 U/mg,酶活回收率为10.8%。米胚GAD的相对分子质量为78 ku,亚基相对分子质量为40 ku,说明米胚GAD是由2个相同亚基构成的二聚体。米胚GAD的最适反应温度为40℃,最适反应pH为5.6;米胚GAD的热稳定较差,80℃时酶几乎完全失活;米胚GAD在pH 4.5~8.0较为稳定,能保持88%以上的酶活。米胚GAD对谷氨酸Glu的Km为32.3 mmol/L,Vmax为1.159 mg/min;对磷酸吡哆醛(PLP)的Km为1.7μmol/L,Vmax为1.171 mg/min。K+和Ag2+对米胚GAD的活力有较大抑制,Mg2+、Mn2+、Al3+和Li2+等对活性影响不大,500μmol/L Ca2+对米胚GAD有较强的激活作用。【结论】米胚GAD的性质与其他植物GAD存在差异。

Purification and characterization of glutamate decarboxylase from rice germ