3种淡水鱼病原菌多重PCR检测方法的建立与应用

根据辽宁地区常见淡水鱼病原菌嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、蜡样芽孢杆菌的相关毒力因子，选择特异性较强的嗜水气单胞菌的溶血素(hlyA)基因、迟钝爱德华氏菌的效应蛋白(eseD)基因、蜡样芽孢杆菌非溶血性肠毒素(nheA)基因为分子靶标，分别设计1对特异性引物，建立可同步检测3种菌的多重PCR检测体系。研究结果显示，在3个毒力基因引物浓度均为0.4μmol/L,模板质量浓度为2.5 ng/μL,dNTP和酶添加量分别为2.5μL和0.3μL,退火温度为55℃时，各目的片段均可较好地扩增。敏感性试验结果表明，建立的多重PCR对嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和蜡样芽孢杆菌的最低检测量分别为4.8、3.0 ng和2.6 ng。对临床分离的菌株样本进行检测，与16S rDNA分子鉴定结果的符合率为100%。建立的多重PCR体系检测方法特异、灵敏、快速，可同步完成淡水鱼源的嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和蜡样芽孢杆菌的检测。