利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术定向敲除烟草eIF4E-6基因

马铃薯Y病毒(PVY)是危害烟叶生产的主要病害之一。已有研究表明,烟草对PVY的抗性由隐性抗性基因e IF4E-6控制。本研究利用CRISPR-Cas9技术定向敲除烟草e IF4E-6基因以改良优质烤烟品种K326的PVY抗性。我们构建了2个特异靶向e IF4E-6基因的CRISPR-Cas9载体g1和g2。构建的载体转化烟草品种K326,PCR检测潮霉素B抗性标签鉴定阳性T0代转基因烟草。PCR扩增阳性转基因烟株靶位点周围DNA序列,对PCR产物进行直接测序或克隆测序,筛选自靶位点处发生突变的烟株,得到2个载体各约50株阳性转化T0代烟株。序列分析结果表明,有2株g1载体转化的烟株在靶位点处出现杂合型单碱基缺失,分别有3和4株g1和g2载体转化的烟株在靶位点处出现杂合型1~2个碱基的替换。这些目的基因杂合型突变的T0代烟株为后续自交获得目的基因纯合敲除后代材料并最终获得PVY抗性改良的烟草提供了研究基础。