山莨菪ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以山莨菪为实验材料,通过正交设计与单因素两种试验方法对山莨菪ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA浓度,Mg2+,Taq酶,d NTPs及引物)进行4水平优化与筛选。经过PCR扩增结果的比较与分析,确定各因素的最适浓度,建立山莨菪的最佳ISSR-PCR反应体系。结果表明,25μL最佳反应体系为:3.0 mmol/L Mg2+、0.2 mol/L d NTPs、0.4μmol/L引物、0.5 U Taq DNA酶、40 ng DNA、2.5μL 10×Buffer。在最佳优化体系条件下,从100条引物中筛选出13条ISSR扩增引物,并确定各自最佳退火温度。建立的山莨菪ISSR-PCR反应体系,经过11份山莨菪样品检测,证明该体系稳定,可用于山莨菪遗传差异性分析。