茶树黄烷酮3-羟化酶基因(F3H)的克隆及功能分析 |
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作者姓名: | 胡晓婧 许玉娇 高丽萍 夏涛 王云生 |
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作者单位: | 安徽农业大学生命科学学院;安徽农业大学茶叶生物化学与生物技术重点实验室; |
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基金项目: | 国家自然科学基金(No.31000314,No.31170647,No.31170282和No.31270730) |
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摘 要: | 黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)是类黄酮代谢途径中的关键酶。本研究采用逆转录PCR技术,获取了茶树(Camellia sinensis)F3H的开放阅读框(open reading frame,ORF)包含1 107个碱基,编码含有368个氨基酸的蛋白质,推测分子量为41.46 kD,等电点为5.61;实时荧光定量PCR表明,CsF3H在叶片中表达量较高,且受光照影响;将此基因重组到表达载体PRSF上,导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中进行原核表达,优化原核表达的条件,结果表明,最佳诱导温度28℃、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度1.0 mmol/L、诱导时间5 h;利用高效液相色谱法(HPLC)对重组蛋白进行了体外酶活的检测,结果表明,重组目的蛋白具有F3H酶活性,可将反应底物柚皮素(N)和圣草酚(E)分别转化为二氢山奈素(DHK)和二氢槲皮素(DHQ);当E作为底物时,酶活性明显高于柚皮素。本研究结果为茶树F3H酶动力学研究和其器官组织特异性研究提供了基础资料。
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关 键 词: | 茶树 黄烷酮-羟化酶(FH) 原核表达 酶活性 |
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