莱姆病螺旋体端粒解离酶的表达纯化及其晶体衍射分析

【目的】对莱姆病螺旋体（Borrelia burgdorferi）端粒解离酶（telomere resolvase，ResT）进行原核可溶性表达纯化，并筛选高衍射度的ResT-DNA复合物晶体，为探究ResT DNA复合物的结构和功能奠定基础。【方法】合成pET28-b-ResT表达质粒，构建原核表达载体pSUMO-ResT，分析ResT可溶性蛋白在BL21(DE3)、BL21(DE3) pLysS、BL21 Gold(DE3) pLysS、BL21 Codon Plus(DE3)、Rosetta(DE3)和Rosetta(DE3) pLysS中的表达量，获得最优的ResT原核表达菌株。基于AlphaFold预测的ResT蛋白模型，利用定点突变及ResT可溶性蛋白表达分析，获得高效可溶性表达ResT突变体。经Ni-NTA亲和层析、HiTrap Heparin HP亲和层析及分子筛层析对ResT突变体 ResT（W94H）进行蛋白纯化。利用EMAS检测ResT（W94H）与DNA的结合能力。使用蛋白晶体接种（seeding）和交叉接种（cross-seeding）方法，利用多种商业化结晶试剂盒筛选并优化ResT-DNA复合物的结晶条件，对复合物晶体进行X射线衍射分析。【结果】BL21 Gold(DE3) pLysS菌株是ResT最佳的高效可溶性表达菌株，W94H突变体比野生型具有更强的可溶性表达。获得了高纯度（95%）且高质量浓度（15 mg/mL）的ResT（W94H），其能够与底物DNA形成稳定的ResT DNA复合物。在18 ℃下，ResT DNA最佳结晶条件是：PEG3350 150 g/L、二甲苯二酸钠0.1 mol/L（pH 6.6）、NaCl 0.15 mol/L，ResT-DNA晶体分辨率最高为3.52 ?，晶体空间群为P4。【结论】得到了高纯度ResT (W94H）蛋白，获得了ResT-DNA复合物晶体。

Expression,purification and preliminary X-ray diffraction of telomere resolvase ResT from Borrelia burgdorferi