| 摘 要： | 为明确植物光合作用中镁离子螯合酶CHLI与CHLD亚基形成复合物CHLI-CHLD这一重要过程的机制,首先需要获得可溶性CHLI和CHLD蛋白并确定其复合体装配。通过分子克隆技术构建截断的CHLI和CHLD重组体表达质粒。将其分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。通过Ni琼脂糖树脂(Ni sepharose 6 Fast Flow)和谷胱甘肽琼脂糖树脂(Glutathionsepharose 4 Fast Flow)亲和层析纯化可溶性重组蛋白。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和TEV酶切试验验证目标蛋白。采用GST-Pulldown试验鉴定CHLI与CHLD的相互作用。通过凝胶过滤层析和SDSPAGE测定复合体中CHLI与CHLD蛋白的比例。结果表明:成功构建了截断的CHLI和CHLD重组体表达质粒p ET-28a-CHLI(13-357),p ET-28a-CHLD(20-676)及p GEX-4T-2-CHLD(20-767);在18℃,0.2mmol·L-1 IPTG条件下诱导16h后,成功获得了可溶性的CHLI(13-357),CHLD(20-676)和GST-CHLD(20-676)重组表达蛋白;CHLI与CHLD存在直接相互作用且需要Mg2+和ATP;稳定复合体CHLI-CHLD的亚基比例为1∶1。综上表明原核表达及纯化镁离子螯合酶CHLI与CHLD亚基蛋白,在Mg2+和ATP存在的条件下通过凝胶过滤层析可获得1∶1的稳定复合体CHLI-CHLD。
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