杨树Na+/H+反向运输蛋白基因(PtNHX1、PtNHX6)的克隆和检测

Na /H 反向运输蛋白基因(NHX)是在细菌、植物和动物体内普遍存在的一类膜蛋白基因家族.迄今已在模式植物拟南芥中分离出AtNHX1、AtNHX2、AtNHX3、 AtNHX4、 AtNHX5和 AtNHX6共6个成员,并发现部分成员对盐胁迫有不同程度的响应.以AtNHX1和AtNHX6的cDNA核苷酸序列为信息探针, 基于可利用的杨树EST数据库和毛果杨全基因组测序结果,通过电子杂交辅助的克隆技术,从毛白杨形成层cDNA中分离得到长度分别为1 635 bp和1 709 bp的2个cDNA,其分别含有编码544个和526个氨基酸残基的完整开放阅读框. 由它们所推导的蛋白质序列与拟南芥、水稻、小麦和玉米的NHX1和NHX6基因的蛋白质序列高度同源, 同源性分别为79%、76%、69%和74%以及82%、82%、27%和26%, 故将其命名为PtNHX1和PtNHX6(GenBank 注册号分别为AY660749和AY832912).Southern 杂交分析表明, PtNHX1和PtNHX6均为低拷贝基因(或有一些高度同源的基因),在杨树基因组中以1 ～ 4个拷贝形式存在.组织特异性RT-PCR结果显示, PtNHX1和PtNHX6基因在杨树根、茎和叶片中均有表达,但其表达模式稍有不同:PtNHX1在根部、形成层、未成熟木质部、成熟叶和嫩叶中均高度表达,在韧皮部和成熟木质部中有少量表达,而PtNHX6在根部、成熟叶和嫩叶中表达丰度较高,在韧皮部、形成层、未成熟木质部表达丰度较低,在成熟木质部中表达丰度极低.NaCl诱导的杨树叶片差异表达RT-PCR检测结果初步表明,PtNHX1和PtNHX6基因均受盐诱导表达,当溶液中NaCl浓度在100～400 mmol·L-1内,随着盐浓度的提高,PtNHX1和PtNHX6基因的表达丰度逐渐增强,但超过400 mmol·L-1后,其表达丰度均有所降低,这与所测定的叶片ABA含量匹配.

Isolation and Characterization of Two NaCl-Inducible Vacuolar Na+/H+ Antiporter Genes (PtNHX1, PtNHX6) in Populus