纤维糊精酶DM1与CBD的融合及融合酶性质分析

纤维糊精酶（cellodextrinase）属纤维素酶类中的一类，可以从短链纤维素分子上水解糖苷键生成葡萄糖或纤维二糖。曾克隆了纤维糊精酶DM1的编码基因，该酶与生黄瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）的Cellodextrinase A的一致性为52％。通过人工合成基因的方法合成了细菌来源的3个分别为家族_4_9（GenBank索引号为AAA73869）、家族Ⅲc（GenBank索引号为BABB33148）和家族10（GenBank索引号为CAA60493）的纤维素结合功能域（CBD）和连接桥（linker）的DNA序列。通过把编码纤维糊精酶DM1（GenBank索引号为ACA61162）的催化功能域（CD）的DNA序列与合成的CBD和连接桥的DNA序列进行融合，构建了3个融合酶，并分别在大肠杆菌BL21中得到过量表达。纤维素结合实验表明，3个纯化的融合酶对结晶纤维索（Avicel）和滤纸粉末均有结合能力，融合酶CBD_4_9-DM1、DM1-CBD10和DM1-CBDⅢc与结晶纤维素（Avicel）结合的蛋白质占总蛋白的比例分别为58．60％、51．16％和21．13％，与滤纸粉末结合的蛋白质占总蛋白的比例分别为65．59％、60．47％和22．54％，证实与原始酶相比3个融合酶的CBD均有纤维素结合的功能。酶学特性研究表明，融合酶的最适pH、最适温度、pH稳定性和温度稳定性等没有显著改变，均未检测到3个融合酶有新的活性，但它们对p-nitrophenyl β-D-cellobioside（pNPC）、p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside（pNPG）和lichenan等底物的比活力显著降低。3个融合酶CBD_4_9-DM1、DM1-CBD10和DM1-CBDⅢc对pNPC的比活力分别为原始酶DM1的26％、2％和2％，对lichenan的比活力分别为原始酶DM1的12％、8％和2％，几乎检测不到后两个融合酶对pNPG的酶活。

Fused cellodextrinase DM1 with CBDs and characterization of fused enzymes

Cellodextrinases belong to a class of cellulases and can hydrolyze short-chain cellulose to produce cellobiose or glucose.A cellodextrinase(DM1)-encoding gene was previously cloned from uncultured microorganism of the contents of buffalo rumen.DM1 exhibits 52% identity with cellodextrinase A of Ruminococcus flavefaciens.In this study,we used the PCR-based two-step DNA synthesis method to synthesize three DNA sequences encoding cellulose binding domains(CBDs)including their linker peptides.The three CBDs bel...