基于gB基因的IBRV微滴式数字PCR检测方法的建立及初步应用

为实现牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)精准的定量检测，以IBRV gB基因为靶基因，建立IBRV微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法，进行了ddPCR退火温度、引物和探针浓度的优化、特异性和灵敏性试验。结果显示，建立的ddPCR方法最佳退火温度为56.5℃;反应体系中最佳引物、探针浓度分别为900和250 nmol/L;能够实现IBRV的特异性检测，与其他常见的牛呼吸系统疫病病原无交叉反应；以重组质粒pMD19-T-gB为模板，ddPCR方法的检出限为1.8 copies/μL,是实时荧光PCR方法敏感性的10倍。对119份具有呼吸道症状的牛鼻拭子样本分别进行ddPCR方法和实时荧光PCR方法进行检测，结果显示，ddPCR方法和实时荧光PCR方法的检出率分别为(15.13%,18/119)和(12.60%,15/119)。本研究建立的ddPCR方法特异性强、灵敏度高，可作为牛呼吸道临床样品中IBRV精准定量检测的有效手段。