应用Cas9 RNPs进行绵羊FecB基因型检测的可行性研究

为了研究Cas9 RNPs用于绵羊FecB基因分型的可行性，试验以FecB基因BB、B+、++型的绵羊个体为试验动物提取基因组DNA。基于Cas9 RNPs的体外DNA定点内切酶活性，用FecB基因靶位点的特异性引物扩增产物作为底物，利用大肠杆菌共表达纯化获得Cas9 RNPs,对不同FecB基因型目标样本进行酶切检测。结果表明：SDS-PAGE电泳结果显示，在130～180 kD之间有一条与预期大小相符的特异蛋白条带；3种基因型的靶DNA均被切割为185 bp和368 bp两个片段；绵羊FecB++型成纤维细胞Cas9 RNPs电转染的突变检测结果显示，纯化的两个Cas9 RNPs都具有基因组编辑活性。说明本研究获得的Cas9 RNPs在体外和细胞内都具有良好的酶活性，但未能区分绵羊FecB基因型。