| 山黧豆CASase基因DNA全长序列的扩增及CRISPR/Cas9敲除载体的构建 |
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| 引用本文： | 陶英杰,刘凤娟,毕春晓,等. 山黧豆CASase基因DNA全长序列的扩增及CRISPR/Cas9敲除载体的构建[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2018, 46(8): 23-28 |
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| 作者姓名： | 陶英杰 刘凤娟 毕春晓 等 |
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| 作者单位： | 西北农林科技大学生命科学学院 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金项目（31401910）；中国博士后科学基金面上项目（2016M590975）；陕西省博士后科研项目（2016BSHEDZZ119）；中央高校基本科研业务费资助项目（2014YB040） |
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| 摘 要： | 【目的】克隆山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因(CASase)DNA全长序列,构建CRISPR/Cas9敲除载体,为筛选"低毒、高硫"山黧豆品系奠定基础。【方法】以萌发4d山黧豆幼苗根部为材料,提取其基因组DNA,利用PCR克隆CASase基因全长;经序列同源性、内含子、外显子、sgRNA靶位点和脱靶分析后,在CASasecDNA上选取5个sgRNA靶位点进行寡核苷酸链设计和体外活性检测;从5个sgRNA靶位点中取活性较高的4个sgRNA,利用酶切连接法构建基因敲除载体pPLHACas9-sgRNA20r、pPLHACas9-sgRNA68r、pPLHACas9-sgRNA225f和pPLHACas9-sgRNA256f。【结果】获得了CASase基因3 143bp的DNA全长序列,该序列编码β-腈基丙氨酸合成酶;在CASase cDNA中选取5个sgRNA靶位点在体外均能有效剪切靶序列;菌落PCR检测结果显示,4个CRISPR/Cas9基因敲除载体构建成功。【结论】克隆了山黧豆CASase基因DNA全长,成功构建了该基因上4个sgRNA靶位点的CRISPR/Cas9敲除载体。
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| 关 键 词： | 山黧豆；CASase基因；基因克隆；载体构建；CRISPR/Cas9系统 |
| 收稿时间： | 2017-05-26 |
Amplification of CASase gene from Lathyrus sativus and construction of its knock-out vector via CRISPR/Cas9 system |
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| TAO Yingjie,LIU Fengjuan and BI Chunxiao,et al. Amplification of CASase gene from Lathyrus sativus and construction of its knock-out vector via CRISPR/Cas9 system[J]. Journal of Northwest A&F University（Natural Science Edition）, 2018, 46(8): 23-28 |
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| Authors: | TAO Yingjie LIU Fengjuan BI Chunxiao et al |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | Lathyrus sativus CASase gene gene cloning knock-out vector construction CRISPR/Cas9 system |
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