水牛抑制素α亚基基因RNAi载体构建与检测

抑制素通过反馈抑制促卵泡素的合成与分泌影响动物的生殖功能，将动物的繁殖力控制在种属特有的水平。为探讨通过抑制素基因沉默提高水牛繁殖力的可行性，本文构建并筛选了水牛抑制素α亚基基因的RNAi载体。根据实验室克隆的水牛INH—α基因序列，设计合成了5对特异性单链siRNA序列，经退火形成双链，连入pSilencer4．1-CMVn60载体。重组质粒经酶切及测序正确后转染水牛卵泡颗粒细胞。48h后，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测不同组转染细胞中INH—α基因的相对表达水平，再选择沉默效率高的载体分别检测转染后24、48、72和96h抑制效率的变化。结果显示，经酶切和烈序验证成功构建pSilencer4．1—145、pSilencer4．1-308、pSilencer4．1-769、pSilencer4．1-1013和pSilencer4．1—1053共5个重组RNAi表达载体，其中pSilencer4．1-308、pSilencer4．1—769、pSilencer4．1—1013和pSilencer4．1-1053具有抑制效果，抑制效率分别为58．8％、44．9％、67．4％和43．9％。选择pSileneer4．1—1013载体转染颗粒细胞24、48、72和96h后的抑制效率分别为27．1％、61．0％、57．0％、41．2％，转染48h后抑制效率最高。本研究成功构建了有效抑制的水牛INH—α基因表达的RNAi载体，为研制INH—α沉默的转基因水牛新品系奠定了基础。