| 摘 要： | 【目的】分离紫花苜蓿(Medicago sativa L.)油菜素内酯(brassionsterinds,BRs)合成酶基因MsDWF4,分析基因表达特性,开展基因的耐盐性研究,为揭示MsDWF4对紫花苜蓿非生物胁迫的调控机制提供参考。【方法】根据已知的拟南芥DWF4序列,应用同源克隆技术获得紫花苜蓿MsDWF4,对序列进行生物信息学分析。利用qRT-PCR技术分析MsDWF4的组织表达特异性,及其在多种非生物胁迫(高温、冷害、干旱和高盐)和激素(生长素、油菜素内酯、脱落酸和茉莉酸)处理下的表达模式;构建MsDWF4超表达载体,利用农杆菌介导遗传转化法转化紫花苜蓿,获得超表达MsDWF4的紫花苜蓿株系,用高盐(200 mmol·L~(-1) NaCl)处理紫花苜蓿转基因株系并结合抗氧化酶活性分析,研究MsDWF4是否提高紫花苜蓿的耐盐性。【结果】获得MsDWF4的cDNA序列,其CDS全长1 470 bp,编码489个氨基酸,该基因编码的蛋白质为P450超家族成员,共含有67个激酶磷酸化位点。序列分析和系统发育树分析表明紫花苜蓿MsDWF4与蒺藜苜蓿DWF4的亲缘关系最近,与禾本科的亲缘关系最远。组织特异性表达分析表明,MsDWF4在根尖中表达量最高,花和叶中次之。高温、冷、PEG、NaCl、ABA和IAA均诱导该基因在植株地上部和根部的表达;在BR处理下,MsDWF4在地上部下调表达,而在根部先被诱导后被抑制;JA处理下,MsDWF4在地上部和根中皆被抑制。构建35S∷MsDWF4超表达载体,并通过农杆菌介导的方式转化紫花苜蓿,PCR鉴定结果显示MsDWF4已经成功转入紫花苜蓿,并获得6个转基因阳性株系。盐胁迫处理下,转基因株系MsDWF4的表达量和抗氧化酶活性均显著高于对照。【结论】获得紫花苜蓿油菜素内酯合成酶基因MsDWF4的CDS序列;该基因在根尖等生长旺盛部位表达最高,基因表达响应多种逆境胁迫和外源激素处理;MsDWF4提高转基因紫花苜蓿对盐胁迫的抗性。MsDWF4可能参与转基因紫花苜蓿的多种逆境响应过程,并且正向调控紫花苜蓿的耐盐性。
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