| 摘 要： | 【目的】研究vvi-miR160家族(vvi-miR160s)及其靶基因在‘魏可’葡萄种子发育过程中的作用,探究其应答赤霉素(GA)调控葡萄果实无核的潜在机理。【方法】采用miR-RACE、生物信息学分析、RT-qPCR、RLM-RACE等方法,鉴定vvi-miR160家族成员及其靶基因,分析vvi-miR160s及其靶基因应答GA的时空表达模式及其潜在功能。【结果】花前GA处理强烈抑制‘魏可’葡萄胚珠及种子发育,高效诱导其无核,且无核率达99.8%。克隆鉴定了VvMIR160s前体基因序列(501 bp)及成熟体序列,且它们在不同物种间具有较高的保守性;基于vvi-miR160s序列,预测到靶基因VvARF18,利用RLM-RACE技术检测到vvi-miR160s对VvARF18的裂解位点在第10和第11位之间,裂解频度9/17,证明VvARF18是vvi-miR160s的真实靶基因。该靶基因编码683个氨基酸,在398—411位存在核定位信号,且该蛋白亚细胞定位于细胞核上。VvARF18与其他物种间序列的同源保守性较高,基因结构相似,其中VvARF18蛋白与茶、烟草、梅花等物种亲缘关系较近。VvARF18启动子中包含4种作用元件,且含有较多激素相关元件。RT-qPCR结果显示,随着葡萄果实的发育,vvi-miR160c/d/e呈现‘V’形表达趋势,在硬核种子发育期表达较低,而VvARF18表现出与前者相反的表达趋势,在硬核种子发育期呈现高表达,表明vvi-miR160c/d/e对VvARF18负调控,但vvi-miR160a/b与VvARF18表达水平却不存在明显负相关。GA处理极显著地上调了vvi-miR160a/b在葡萄硬核种子发育期的表达,同时也显著抑制了VvARF18在同时期的表达,且它们的表达水平呈负相关,表明GA处理促进了vvi-miR160a/b对VvARF18的负调控作用;相反,GA减弱了vvi-miR160c/d/e对VvARF18的负调控作用。【结论】在vvi-miR160家族中,vvi-miR160c/d/e可能介导VvARF18在葡萄种子发育的特定阶段调控种子的发育形成,而vvi-miR160a/b可能主要介导VvARF18参与调控GA诱导葡萄种子败育的过程。
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