咖啡酸苯乙酯通过AMPK/FOXO3a信号通路缓解猪精液常温保存氧化应激的作用机制

【目的】探究咖啡酸苯乙酯（caffeic acid phenethyl ester,CAPE）通过AMPK/FOXO3a信号通路缓解氧化应激对猪精液的影响及其分子机制。【方法】选取8头成年（1—2岁）、健康状况良好长白种公猪进行鲜精采集,将质检合格的样品混池待用。试验设计如下：首先,在常温基础稀释液中分别添加0、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 g·L^-1浓度的CAPE,将精液样品与各个浓度组依次混合后放置室温平衡,随即转入17 ℃电子恒温冰箱进行常温保存。全自动精子分析仪（CASA）测定1—5 d精子运动学参数（总活率与渐进性活力）,筛选出最佳适宜浓度为0.06 g·L^-1。其次,将0.06 g·L^-1 CAPE与400 μmol·L^-1的H₂O₂建立氧化胁迫模型,在第1、3、5天分别采用CASA测定精子总活率与渐进性活力,荧光探针技术评估质膜完整性与顶体完整性,抗氧化试剂盒检测过氧化氢酶（catalase,CAT）与超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性,在第5 天利用实时荧光定量 PCR技术测定AMPK/FOXO3a信号通路下游靶向基因（AMPK、FOXO3a、SOD1、SOD2、CAT）及凋亡基因BAX的mRNA表达水平,蛋白免疫印记技术测定AMPK、p-AMPK蛋白表达。【结果】（1）浓度筛选试验中,0.06 g·L^-1的CAPE在保存第3 天显著提高精子的总活率并维持至第5天（P<0.05）,不仅如此,精子的渐进性活力在第1 天显著高于其他处理组（P<0.05）。（2）氧化胁迫试验中,H₂O₂处理组的精子质膜完整性、顶体完整性、总活率、渐进性活力、SOD与CAT活性在保存的第5天均极限显著低于空白组与CAPE+H₂O₂混合组（P<0.001）,而空白组与CAPE+H₂O₂混合组的总活率、顶体完整性、CAT与SOD活性不存在显著差异（P>0.05）。与CAPE+H₂O₂混合组相比,H₂O₂处理组AMPK、FOXO3a、SOD1、SOD2、CAT的mRNA表达水平显著降低（P<0.05）,BAX的表达水平显著升高（P<0.05）,而空白组与CAPE+H₂O₂混合组的AMPK、SOD1、CAT与BAX不存在显著差异（P>0.05）。在蛋白表达水平中,CAPE+H₂O₂混合组与H₂O₂组相比,AMPK、p-AMPK 与p-AMPK/AMPK比率显著提升（P <0.05）。【结论】在常温基础稀释液中添加0.06 g·L^-1CAPE可通过促进磷酸化AMPK的表达,诱导AMPK/FOXO3a信号下游抗氧化分子的转录,继而缓解H₂O₂介导的氧化危害对精液品质产生的影响,延长精液的保存时间,但CAPE保护精子氧化损伤更为深入的分子机制仍需作进一步探究。

Effect and Mechanism of Caffeic Acid Phenethyl Ester Alleviates Oxidative Stress in Liquid Preservation of Boar Semen Via the AMPK/FOXO3a Signaling Pathway