黏菌素促进mcr-1阳性IncI2质粒在大肠杆菌间的接合转移

【背景】黏菌素是人医临床治疗多重耐药革兰阴性菌感染的“最后一道防线”药物,其同时作为饲料添加剂及治疗用药长期用于畜禽养殖业。2015年,我国研究人员首次报道了质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1,预示该道防线面临被攻破的风险。然而,杀菌浓度及亚抑菌浓度的黏菌素对mcr-1阳性质粒传播的影响仍未知。【目的】以流行最广的mcr-1阳性IncI2型质粒为研究对象,探究不同浓度黏菌素对该质粒接合转移频率的影响,为黏菌素的科学使用提供理论依据。【方法】使用肉汤法进行了不同浓度黏菌素（0.02-4 μg·mL^-1）作用下携带mcr-1的IncI2型质粒的接合转移试验。通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）及构建的公式计算不同时间点（1-24 h）的接合转移频率,并分析不同浓度黏菌素对IncI2质粒接合转移频率的影响。使用PI染料、活性氧（ROS）检测试剂盒测定不同浓度黏菌素下供体菌和受体菌的细胞膜透过性和ROS产生量。选取了对照组与低中高浓度3个处理组（0.02、1、4 μg·mL^-1）进行了转录组测序,使用Deseq2软件进行基因差异表达分析。采用Prism v8.2.0软件对不同组间接合转移频率、细胞膜透过性及ROS产生量的差异进行统计学分析。【结果】结合本研究建立的接合转移频率计算公式表明黏菌素浓度为4 μg·mL^-1时可在不同时间点提高mcr-1阳性IncI2质粒3-10倍的接合转移频率,而其他浓度则无显著差异。转录组结果显示,与对照组相比,低中高浓度黏菌素均可显著提高IncI2质粒上IV型分泌系统相关基因的表达,其中包括virB1、virB2、virB5以及traC。此外,黏菌素增加了I型菌毛合成基因fim的转录水平。PI染色结果显示当黏菌素浓度为2和4 μg·mL^-1时,可增强供体菌和受体菌的细胞膜透过性,且转录组结果也显示膜相关基因（ompAX、bamDE、lolB、yiaD、csgEF）的转录水平均出现显著上调。但是黏菌素作用后ROS产生量及相关基因的转录水平无显著提高。【结论】揭示了黏菌素可通过增加细菌IV型分泌系统活性、细胞膜透过性和菌毛的生成从而提高mcr-1阳性IncI2质粒在大肠杆菌间的接合转移频率。研究结果提示,杀菌浓度无法完全杀死mcr-1阳性大肠杆菌的同时,还能增加质粒传播速度。因此,畜禽养殖业中黏菌素的治疗使用可能维持mcr-1阳性质粒的存在及传播,此外鉴于黏菌素已批准用于人医临床,该现象有可能引起临床黏菌素治疗mcr-1阳性病原菌的失败。

Colistin Promotes mcr-1-positive IncI2 Plasmid Conjugation Between Escherichia coli