羽衣甘蓝ARC1 蛋白的原核表达、纯化及泛素连接酶活性分析

 ARC1 是植物特有的一类含有U-box/ARM 结构域的蛋白，在芸薹属植物自交不亲和 （self-incompatibility，SI）信号转导中起着正向调控因子的作用。将羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）BoARC1 编码区的序列连接到原核表达载体pET-14b 上，通过酶切鉴定和测序分析，构建pET-14b- BoARC1 表达质粒；将获得的阳性表达质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）pLysS 中，利用IPTG 进行诱导表达。SDS-PAGE 结果显示，在分子量69 kD 处有BoARC1 蛋白特异性地诱导表达；利用Ni2+-NTA 树脂通过亲和层析的方法获得BoARC1 融合蛋白。在泛素激活酶（E1）、泛素结合酶UBC7（E2）和泛素 体外泛素化反应后，通过免疫印迹的方法检测，显示出BoARC1 融合蛋白能够将底物进行多泛素化修饰； 当U-box 中保守位点第323 位Pro 突变为Ala 或其他泛素化组分缺少时，底物不能被泛素化修饰。