甘蓝花粉管钙感应蛋白CaM 与SRK 相互作用研究

 为研究甘蓝花粉管钙感应蛋白CaM 与SRK 相互作用的分子机理及其可能相互作用的区域， 从自交不亲和甘蓝材料‘E1’中分别克隆得到CaM12 基因450 bp 及S 位点受体激酶（SRK7）基因全长 序列2 118 bp，并亚克隆得到SRK 胞外域（eSRK）和胞内激酶域（iSRK），构建原核表达载体pGEX-CaM12、 pCold-eSRK 和pCold-iSRK，转化E. coli BL21（DE3）进行原核表达，表达产物纯化后进行体外相互作用， 结果表明CaM12 能够与SRK7 进行相互作用，但作用区域是iSRK7 而不是eSRK7。为进一步验证其相互 作用，本研究利用酵母双杂交系统，构建pGBKT7-CaM12、pGADT7-eSRK7、pGADT7-iSRK7 和 pGADT7-SRK7 酵母表达载体，转化相应酵母Y2HGold 和Y187 感受态细胞后未出现自激活和毒性现象， 相互作用结果与原核表达检测一致。同时将CaM12 的3 个EF-hands 结构域突变体CaM12-2-、CaM12-23- 和CaM12-234-与iSRK7 分别构建酵母表达载体pGADT7-CAM12-2-、pGADT7-CAM12-23-、pGADT7- CAM12-234-，检测其相互作用。结果表明CaM12 EF-hands 突变体CaM12-2-、CaM12-23-和CaM12-234- 在酵母双杂交系统中均不能与iSRK7 片段发生相互作用，说明CaM12 的EF-hands 结构域突变后失去结 合Ca2+能力而不能与iSRK7 相互作用。该研究可为自交不亲和机理提供新的参考依据。 关键