番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重PCR检测方法

针对引起番茄细菌性病害的细菌性斑点病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato，Pst）、溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis，Cmm）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum，Rs）以及疮痂病菌（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria，Xcv），建立了四重PCR检测技术，为病害的快速、准确诊断提供技术支持。根据gap1基因设计Pst特异性引物BW-F/BW-R，经PCR条件优化，扩增出了375 bp的特异性片段。将设计的引物与已报道的3种细菌特异性引物组合，通过设定不同的退火温度、引物浓度、循环次数以及延伸时间，探索影响四重PCR扩增的因素，优化了其反应体系。四重PCR反应体系中的引物对BW-F/BW-R、Fan1/Fan2、RS-1-F/RS-3-R和XCVF/XCVR可分别扩增出细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌长度为375、146、716和517 bp的特异性目的片段，反应体系退火温度为57.1 ℃，4对引物的终浓度分别为0.24、0.16、0.16和0.08 μmol ? L-1，延伸时间45 s，35个循环。该四重PCR反应体系可快速检测田间番茄发病植株中的细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌，灵敏度达到10-1 ng ? μL-1。