猪食欲肽2受体突变体真核表达载体的构建及其对cAMP信号通路的影响

试验旨在构建猪食欲肽2受体(porcine orexin 2receptor,pOX2R)突变体的真核表达载体,探究其野生型与突变体的基础药理学活性差异。以pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R野生型质粒为模板,设计特异性引物单点突变构建4种突变体:pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-P10S、pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-P11T、pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-V308I和pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-T401I,将pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R野生型和4种突变体分别瞬时转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告基因检测法测定pOX2R野生型及突变体的基础活性,并检测不同浓度激动剂作用下细胞内cAMP水平,随后用内源性激动剂食欲肽A(OXA)及食欲肽B(OXB)分别对野生型及突变体进行刺激。结果显示,4个突变体构建成功,pOX2R的第10、11、308和401位氨基酸分别突变为丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。将pOX2R的野生型及4个突变体瞬时转染HEK293T细胞后,野生型与突变体的基础活性值无显著差异(P0.05),表明这4个位点的氨基酸突变对其受体的基础表达信号无显著影响。与野生型受体相比,突变型受体对激动剂OXB的响应无显著差异(P0.05),而突变体P10S、P11T和T401I对激动剂OXA的响应EC50显著降低(P0.05),其Rmax无显著差异(P0.05)。推测第10、11和401位点的氨基酸突变可能影响了激动剂OXA与受体的结合,降低了激动剂的激动效应。本研究结果为进一步体外研究pOX2R的功能奠定了基础。