泛素结合酶UBE2T基因在布鲁氏菌感染过程中的作用

【目的】探讨泛素结合酶E2T（UBE2T）在布鲁氏菌感染过程中的功能。【方法】构建UBE2T基因过表达载体pLVX-puro-UBE2T，对其进行PCR和EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切验证，并将其转染小鼠巨噬细胞RAW264.7，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测UBE2T基因过表达效果。设计并合成3条UBE2T基因沉默表达的siRNA（UBE2T-379-siRNA、UBE2T-599-siRNA和UBE2T-661-siRNA），将其转染小鼠巨噬细胞RAW264.7，利用qRT-PCR检测UBE2T基因沉默表达效果。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）试验，检测UBE2T沉默或过表达对RAW264.7细胞活性的影响。利用qRT-PCR，检测M5-90感染对RAW264.7细胞UBE2T基因相对表达量的影响，以及对过表达或沉默表达UBE2T基因的RAW264.7细胞中含pyrin结构域NOD样受体家族3（NLRP3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）基因相对表达量的影响。用布鲁氏菌M5-90菌株感染过表达和沉默UBE2T基因的RAW264.7细胞，用活菌计数法检测UBE2T沉默或过表达对RAW264.7细胞内布鲁氏菌增殖的影响，利用相应的试剂盒检测细胞乳酸脱氢酶（LDH）水平、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）活性及白细胞介素6（IL-6）、IL-18、IL-1β和γ-干扰素（IFN-γ）等细胞因子的水平。【结果】成功构建了UBE2T基因过表达载体pLVX-puro-UBE2T，过表达效果良好。3条siRNA中，UBE2T-661-siRNA的干扰效果最佳，其对UBE2T基因的沉默效率为84%。UBE2T沉默或过表达对RAW264.7细胞活性无影响。M5-90感染可提高RAW264.7细胞UBE2T的表达量；沉默UBE2T可提高M5-90介导的NLRP3和Caspase-1的表达，而过表达UBE2T会抑制M5-90介导的NLRP3表达，提高M5-90介导的Caspase-1表达。沉默表达UBE2T可抑制胞内M5-90的增殖，而过表达UBE2T可促进胞内M5-90的增殖。沉默表达UBE2T可抑制M5-90介导的LDH水平，提高Caspase-3活性及IFN-γ、IL-6和IL-1β水平；而过表达UBE2T可提高M5-90介导的LDH水平，抑制Caspase-3的活性及IFN-γ、IL-1β水平。【结论】泛素结合酶UBE2T对胞内布鲁氏菌增殖具有正调控作用。

Role of ubiquitinase-binding enzyme UBE2T gene in Brucella infection