| 利用RNAi抑制牛骨髓间充质干细胞中朊蛋白基因（PRNP）的表达 |
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| 作者姓名： | 宋少康 董雅娟 柏学进 王文明 刘玮 牛召姗 赵仕全 杨莉 |
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| 作者单位： | [1]青岛农业大学动物胚胎工程中心,山东青岛266109 [2]山东省黑牛繁育工程技术研究中心,山东青岛266109 [3]山东布莱凯特黑牛科技股份有限公司,山东淄博256306 |
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| 基金项目： | 国家“抗病转基因牛新品种培育”资助项目（2008ZX08007-004） |
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| 摘 要： | 利用RNAi技术,根据牛源PRNP基因eDNA设计3段siRNA序列和1个阴性对照序列,分别将其连接到RNA干扰载体pRNAT-U6．1／Neo上构建成shRNA载体,并将shRNA载体转染牛骨髓间充质干细胞（BMSC）;通过Real-timePCR和WesternBlotting筛选抑制效果最佳的载体;并用800mg／LG418对转染最佳载体的细胞进行药物筛选。结果显示：成功构建了3个靶向shRNA载体和1个阴性对照shRNA载体;转染后48h在荧光镜下检测各组均可观察到绿色荧光的表达;Real-timePCR和WesternBlotting结果显示,3个靶向shRNA载体在不同时间段均在一定程度上下调了PRNPmRNA的表达,抑制了朊蛋白PrP^c 的生成,得到了1个最佳干扰载体sh3;通过药物筛选出了稳定转染的细胞单克隆。本研究获得了1个有效抑制朊蛋白基因表达的shRNA载体,并筛选出稳定转染的细胞单克隆,上述结果可为抗疯牛病体细胞核移植提供供体细胞。
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| 关 键 词： | 疯牛病 PRNP 朊蛋白PrP^c shRNA BMSC |
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