实时荧光定量RT-PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立

本试验旨在建立一种快速、灵敏的诊断小反刍兽疫的方法。本研究通过RT-PCR方法扩增小反刍兽疫病毒N基因，连接到pMD19-T克隆载体上，构建质粒标准品。根据GenBank中中国流行毒株及Nigeria 75/1疫苗株N基因保守序列设计引物，利用SYBR Green Ⅰ法进行实时荧光定量PCR，建立标准曲线，并进行特异性试验、敏感性试验和重复性试验。结果表明，在2.82×10⁰~2.82×10⁷拷贝/μL范围内，Ct值与质粒拷贝数对数值呈良好的线性关系，标准曲线线性关系R²值为0.992；其他病毒无特异性扩增曲线，特异性良好；批内变异系数为0.27%~2.77%，批间变异系数为0.41%~3.39%，重复性较好；检测灵敏度可达2.82拷贝/μL，是普通PCR的1 000倍。用该方法对12份cDNA样品进行检测，9份为阳性，3份为阴性，而普通PCR检测，7份为阳性，5份为阴性，说明本方法比普通PCR灵敏度高。本检测方法的建立对快速、灵敏诊断小反刍兽疫，防止疫情的扩散具有重要意义。