宿主细胞弗林蛋白酶对SARS-CoV-2刺突蛋白切割作用的研究 |
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引用本文: | 刘晓萌,苏文强,郑永辉,李苏楠.宿主细胞弗林蛋白酶对SARS-CoV-2刺突蛋白切割作用的研究[J].中国预防兽医学报,2023(7):672-681. |
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作者姓名: | 刘晓萌 苏文强 郑永辉 李苏楠 |
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作者单位: | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室 |
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基金项目: | 国家自然科学基金(32172836);;黑龙江省博士后科研启动金资助项目(LBK-Q21050); |
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摘 要: | 严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2) S蛋白与宿主表面受体ACE2结合后,S蛋白中的Furin裂解位点RRAR被宿主细胞内的弗林蛋白酶(Furin)识别,并将S蛋白切割为S1/S2亚基。为研究Furin对SARS-CoV-2S蛋白的切割活性、对病毒的感染性及其形成细胞-细胞膜融合(合胞体)的影响,本研究采用套式PCR分别扩增S蛋白Furin裂解位点突变(将裂解位点由RRAR分别突变为RRRR、SRAS和AAAA)的编码基因片段,并分别克隆至pCAGGS载体中,构建重组质粒pRRRR-Flag、 pSRAS-Flag、 pAAAA-Flag,均经酶切和测序鉴定正确后构建pEGFP-RRRR、pEGFP-SRAS、pEGFP-AAAA质粒并经测序鉴定。采用慢病毒包装系统包装慢病毒后感染Huh7细胞,48 h后采用杀稻瘟菌素筛选共表达ACE2和TMPRSS2的Huh7细胞系Huh7-A+T;利用CRISPR-Cas9方法构建Furin敲除(Furin-KO)细胞系,并均经western blot鉴定。结果显示,上述两种细胞均正确构建。将与Flag融合表达的RRAR、 RRR...
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关 键 词: | 严重急性呼吸综合征冠状病毒2 弗林蛋白酶 刺突蛋白 S2亚基切割 共定位 |
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