家蚕AGO2蛋白的单克隆抗体制备

Argonaute(AGO)蛋白家族在小RNA诱导的基因沉默中发挥重要作用。基于家蚕基因组测序发现的AGO蛋白编码序列,选择Bm AGO2为目标蛋白质,制备该蛋白质的单克隆抗体,为进一步研究其介导的miRNA靶基因以及基因调控网络奠定试验基础。通过分析Bm AGO2蛋白的抗原性分布,筛选出Bm AGO2抗原表位区aAGO2,设计引物扩增目的片段,构建重组表达载体p ColdⅡ-aAGO2原核表达aAGO2蛋白,以纯化后的aAGO2蛋白免疫BALB/c小鼠。剖取免疫小鼠脾脏,将脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合。以HAT选择培养基及间接ELISA法筛选阳性克隆,经Western blotting和免疫沉淀检测,获得2株生长状态好、能分泌高效价抗体的单克隆杂交瘤细胞株I5-A9和E1-3。经抗体亚型检测后,选择细胞株I5-A9进行大量培养,菌液注射小鼠腹腔制备的腹水经辛酸-硫酸铵沉淀及Protein A/G亲和层析纯化,获得了纯度较高的Bm AGO2单克隆抗体。利用获得的抗体免疫共沉淀家蚕卵巢培养细胞Bm N以及家蚕5龄幼虫的内源Bm AGO2蛋白,从分离的结合RNA检测到小RNA被显著富集,表明成功制备了可用于免疫共沉淀的Bm AGO2单克隆抗体并分离BmAGO2结合的RNA。