基于RNA-seq的百萨偃麦草染色体特异分子标记开发与应用

【目的】百萨偃麦草（Thinopyrum bessarabicum Löve, 2n = 2x = 14, JJ或E^bE^b）是小麦改良的重要亲缘物种，开发染色体特异分子标记对于加快其有利基因向小麦中的转移和应用有重要意义。【方法】利用百萨偃麦草分蘖期叶片RNA-seq获得的EST序列与节节麦D基因组序列进行比对，鉴定出4 957条没有相似性的序列作为筛选百萨偃麦草特异序列的基础序列。从这些基础序列中随机选择部分序列设计EST-PCR引物507对，通过在普通小麦中国春、百萨偃麦草和中国春-百萨偃麦草双二倍体中的扩增分析，筛选出百萨偃麦草基因组特异标记，然后在已经选育出的8个小麦-百萨偃麦草异染色体系中进行染色体定位，并探讨这些标记在小麦染色体工程中的应用潜力；根据谷类作物的共线性，以百萨偃麦草EST序列设计共线性引物100对，并比较这些引物的扩增和定位结果。【结果】在开发的507对引物中，204对（40.2%）在百萨偃麦草和中国春-百萨偃麦草双二倍体中具有特异扩增，多态率远高于利用小麦（12%）和百萨偃麦草（14%）EST设计的234对共线性引物产生的多态率，建立了高效开发小麦亲缘物种特异标记的新方法；利用8个中国春-百萨偃麦草异染色体系，共定位了198个百萨偃麦草特异标记，分别位于染色体1J（31）、2JS（15）、2JL（26）、3JS（20）、4JS（12）、4JL（12）、5J（27）、6JS（13）、6JL（22）和7JS（20），其中189个是根据百萨偃麦草转录组序列设计；利用定位于1J和6J的特异标记确定了4个易位系的染色体身份，其中1个涉及1J的大片段易位，2个涉及6JS的不同区段易位，1个为小片段中间插入易位；利用这些易位系，将30个1J和12个6J特异标记分别定位于2个物理区段。【结论】通过RNA-seq结合与小麦基因组序列比对可以获得小麦亲缘物种相对特异的EST序列并据此开发引物，建立了开发外源染色体特异标记的新方法，开发的标记可应用于小麦异易位系鉴定和缺失物理图谱的绘制。

Development and Application of Specific Molecular Markers of Thinopyrum bessarabicum Löve Based on RNA-seq