印楝素A无细胞合成体系构建及其合成前体

【目的】印楝素是一种植物源杀虫剂,印楝素A是印楝素的主要活性成分。本研究通过对印楝素A无细胞合成体系制备条件和反应条件的优化,以及印楝素A合成前体的筛选,探讨印楝素A的离体生物合成途径,以为指导构建印楝素异源生物合成平台,实现印楝素的异源生物合成奠定基础。【方法】通过对缓冲液类型、浓度、起始pH、提取时间及料液比进行单因素试验及正交试验优化,构建印楝素A无细胞合成体系;从反应终止试剂及稳定剂、反应温度、反应时间、底物浓度以及辅助因子5个方面优化无细胞合成体系的反应条件。利用印楝素A无细胞合成体系分别以2,3-环氧鲨烯、羊毛甾醇、大戟二烯醇、丁酰鲸鱼醇、nimbin、茄碱苷和脱乙酰茄碱苷为底物,以印楝素A相对产量为评价标准,探讨印楝素A合成前体。【结果】印楝素A无细胞合成体系的构建:以pH7.0的200 mmol·L~(-1) Tris-HCl缓冲液,按1∶20(g·mL~(-1))料液比加入印楝叶片,提取1 h。优化的印楝素A无细胞合成条件为:反应总体积800μL,其中含印楝无细胞提取物300μL(相当于印楝叶0.015 g),100μL 250μmol·L~(-1)的底物(鲨烯)和400μL含有1 mmol·L~(-1) Mg~(2+)、1 mmol·L~(-1) Mn~(2+)、0.1 mmol·L~(-1) ATP、0.1 mmol·L~(-1) NADPH~+和5 mmol·L~(-1)抗坏血酸的缓冲液,在30℃下反应60 min,迅速加入200μL乙酸终止反应。分别以2,3-环氧鲨烯、丁酰鲸鱼醇、大戟二烯醇、nimbin、茄碱苷和脱乙酰茄碱苷为底物,反应完成后,印楝素A含量均有不同程度的增加;羊毛甾醇抑制体系中印楝素A的合成。【结论】羊毛甾醇不是印楝素A的合成前体,2,3-环氧鲨烯和丁酰鲸鱼醇是印楝素A的前体,nimbin、大戟二烯醇、脱乙酰茄碱苷和茄碱苷极可能是印楝素A的合成前体,且茄碱苷位于合成途径较下游的位置。