乳糖酶突变体库的构建及高活性突变体的快速筛选

构建了亮白曲霉来源的β-半乳糖苷酶活性中心的第219位丝氨酸的毕赤酵母饱和突变体库以筛选水解活性提高的乳糖酶。另外,通过以毕赤酵母发酵基础盐诱导培养基代替传统的BMMY培养基来诱导表达β-半乳糖苷酶和其突变体。结果表明,诱导时间在48~60 h且粗酶液中总蛋白量在0.2~0.8 mg/mL时,各乳糖酶的活力均高于其在BMMY培养基中的活力;各乳糖酶的比活力在此阶段保持相对稳定,且与纯化后的酶比活力呈正相关,即各乳糖酶的比活力高低可以粗酶液中乳糖酶的比活力来相对定量。在此基础上,利用高通量的48孔培养板创建了一种简便、高通量从β-半乳糖苷酶突变体库中筛选高水解活力乳糖酶的方法,并应用该方法快速地从突变体库中筛选到3个水解活力显著提高的突变体S-38、S-35和S-1,比活力分别提高了10.3%,9.2%和6%,高通量的筛选方法是定向进化技术中的重要环节,为其顺利开展奠定了基础。