桑树MLX56基因家族特性、克隆及表达分析

【目的】桑树乳胶蛋白基因在抗虫防御过程中起着重要的作用。从桑树基因组数据库中鉴定桑树MLX56基因家族,并进行基因进化、基因结构及基因的表达分析,为桑树MLX56基因的功能研究及利用奠定基础。【方法】利用桑树基因组数据库,采用生物信息学方法,分析桑树MLX56基因家族结构及进化关系,并对MLX56基因家族成员进行鉴定;利用MEGA4.1软件进行系统进化树分析;通过半定量RT-PCR技术研究MLX56基因在桑树不同种及不同组织之间的表达水平,构建原核表达载体p ET-28a-MLX56-6,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导融合蛋白表达,分别收集不同诱导时间段的菌液,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况。将高效表达时段的菌液进行超声破碎,SDS-PAGE检测目的蛋白的可溶性;利用Western Blot印迹验证目的蛋白的表达。并研究该基因对大肠杆菌生长速率的影响。【结果】利用桑树基因组数据库,鉴定6个MLX56家族基因,该家族基因含有2个几丁质结合域,且都含有信号肽,属于分泌蛋白。此外还克隆到1个新的MLX56基因,命名为MLX56-7(Gen Bank登录号为KJ496133)。系统进化树显示桑树MLX56基因与西洋接骨木类橡胶蛋白同源性最高,同源性达66%,与茶树几丁质酶、葡萄几丁质酶同源性较低,同源性分别为49%和48%。半定量RT-PCR分析表明,MLX56-1,MLX56-2,MLX56-4,MLX56-5,MLX56-6和MLX56-7在桑树不同种中均有表达,组织表达特异性分析表明MLX56-2,MLX56-4,MLX56-5,MLX56-6和MLX56-7基因在广东桑‘桂优62号’各个组织中都有表达,MLX56-1基因仅在叶柄及茎中表达,MLX56-3基因在桑树不同种及广东桑‘桂优62号’各个组织中都没有检测到表达。原核表达结果表明,MLX56-6蛋白在终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG诱导下成功表达;融合蛋白的可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在;Western Blot印迹检测也证实大肠杆菌BL21(DE3)中表达了1个分子量为56 k Da的蛋白。但在诱导表达过程中,大肠杆菌BL21(DE3)生长速率受到MLX56-6基因的抑制。【结论】MLX56基因家族在桑树进化过程中发生了基因的重复,且在结构上出现了分化。根据MLX56基因家族的蛋白及结构特征,该基因家族可能属于具有凝集素活性的几丁质酶。MLX56基因在桑树不同种及不同组织中的表达存在差异,暗示这些基因在桑树不同种及不同组织中的功能存在一定差异。