大麦Amy32b的遗传多样性及其对α-淀粉酶活性的影响

【目的】通过对Amy32b遗传多样性研究,发掘与α-淀粉酶活性相关的等位变异。【方法】设计能够覆盖Amy32b序列的特异引物,研究该基因在中国大麦的等位变异类型:单核苷酸多态性位点(SNP)及插入(insert)、缺失(delete)等。利用RT-PCR获得Amy32b的全长cDNA序列,分别将携带等位变异的全长cDNA和截短cDNA连入表达载体pET-28a(+),并对表达产物进行纯化、活力测定及比较研究。【结果】根据对已公布的Amy32b(x05166)的扩增,发现在基因编码区有一多态性位点G/A(cSNP)和1个A碱基的插入/缺失突变。分别位于Amy32b的碱基序列2 269 bp和2 403 bp,其中,G/A转换导致第355位氨基酸由谷氨酸(E)替换为赖氨酸(K);A碱基插入导致终止密码的形成,引发了碱基片段缺失以及编码氨基酸序列和α-淀粉酶蛋白C端的提前终止。克隆出Amy32b全长和截短cDNA,长度分别为1 314 bp和1 266 bp。酶活性测定结果表明,两种全长重组酶(rAmy32b_A和rAmy32b_G)均具有正常且相同的淀粉酶活性,而截短的突变酶(rΔAmy32b)未能测出淀粉酶活性。【结论】Amy32b的碱基插入/缺失突变形成终止子,引发碱基片段缺失和编码α-淀粉酶C端截短,造成酶活性的丧失;而G/A转换造成的氨基酸替换则对该酶活性没有影响。