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坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法的建立
引用本文:于春梅,刁有祥,唐熠,崔京腾,高绪慧,张颖,鞠小军,武利利. 坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法的建立[J]. 中国农业科学, 2012, 45(21): 4492-4500. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.21.018
作者姓名:于春梅  刁有祥  唐熠  崔京腾  高绪慧  张颖  鞠小军  武利利
作者单位:1.山东农业大学动物科技学院  山东泰安 271018
基金项目:国家水禽产业技术体系项目(CARS-43-34)、山东省农业重大应用技术创新项目
摘    要:【目的】利用SYBR GreenⅠ荧光定量技术建立一种相对定量检测坦布苏病毒的方法。【方法】针对坦布苏病毒NS5、E基因分别设计了1对特异性引物,同时设计1对扩增内参基因β-actin引物,将PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,倍比稀释作为质控样品,用于实时荧光定量PCR中NS5、E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建,并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】结果显示标准曲线线性关系R2值均在0.99 以上, 检测极限约为1.0E+01拷贝数质粒DNA;特异性结果表明只能检测到坦布苏病毒的扩增曲线;批内和批间重复性试验的变异系数均小于0.5%;用已建立的方法对临床样品进行3次重复检测,病毒RNA的检出率为100%。【结论】本研究初步建立了基于坦布苏病毒NS5、E基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法,为养鸭场诊断和监测坦布苏病毒提供了一种新的特异、灵敏的检测方法。

关 键 词:坦布苏病毒  NS5基因  E基因  SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR  相对定量  
收稿时间:2012-03-23

Fluorescence Quantitative RT-PCR Assay for Detection of Tembusu Virus
YU Chun-Mei,DIAO You-Xiang,TANG Yi,CUI Jing-Teng,GAO Xu-Hui,ZHANG Ying,JU Xiao-Jun,WU Li-Li. Fluorescence Quantitative RT-PCR Assay for Detection of Tembusu Virus[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(21): 4492-4500. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.21.018
Authors:YU Chun-Mei  DIAO You-Xiang  TANG Yi  CUI Jing-Teng  GAO Xu-Hui  ZHANG Ying  JU Xiao-Jun  WU Li-Li
Abstract:
Keywords:Tembusu virus Tembusu virus  NS5 gene  E gene  SYBR GreenⅠ real-time quantitative PCR assay  relative quantitative
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